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ELISA實驗中的FAQ(二)

作者:admin 信息來源:達科為 日期:20250520 打印 字體:  
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1、整體OD值過高,標準品OD值過飽和
遇到這樣的情況,首先檢測標準品的稀釋情況,確保標準品濃度的正確稀釋。在標準品確保無誤后,若孔板顯色明顯,可參考以下原因及解決方法:
?顯色時間過長或孵育溫度錯誤
解決方法:根據(jù)試劑說明書提供的孵育溫度,適當縮短Avidin-HRP或顯色底物的孵育時間。
?洗滌次數(shù)不夠
解決方法:嚴格按照說明書的洗滌次數(shù)進行
?試劑配制不正確(如檢測抗體、酶等稀釋度是否正確)
解決辦法:嚴格按照試劑說明書進行試劑的配制
?混用其他試劑盒試劑
解決方法:使用本試劑盒內(nèi)配套試劑,不同品牌及不同批次間的試劑之間可能存在不匹配現(xiàn)象
?使用污染的去離子水或者buffer稀釋試劑盒中的試劑
解決方法:使用新鮮的無污染的去離子水或者buffer稀釋試劑
2、標準品OD值正常但樣本OD值過高
?樣本濃度過高
解決方法:稀釋樣本,進行預(yù)實驗確定樣本稀釋倍數(shù)
3、試驗結(jié)果空白背景高
?洗板不干凈
解決方法:充分洗滌,徹底拍干;洗板要防止交叉污染;濃縮洗液準確配制;槍尖盡可能一次性使用;加樣或加酶拍板的濾紙應(yīng)棄去不用,不要反復使用,否則易造成污染;濃縮洗滌液如有結(jié)晶則應(yīng)讓結(jié)晶于室溫全部溶解后再量取稀釋
?顯色液變質(zhì)或者試劑過期
解決方法:檢查試劑盒有效期,如果發(fā)現(xiàn)顯色液顏色變化或試劑過期,請勿使用
?試劑稀釋有誤,如加酶的濃度過高
解決方法:嚴格按說明書所示稀釋倍數(shù)配制
?蒸餾水受酶等污染
解決方法:使用新鮮蒸餾水
?試劑混用
解決方法:不同批號試劑勿混用
?培養(yǎng)箱溫度超過37℃或反應(yīng)時間過長
解決方法:校正培養(yǎng)箱溫育溫度或顯色反應(yīng)時間適當縮短
?檢測試劑加多
解決方法:確保試劑正確稀釋或降低檢測試劑的使用濃度
?添加終止液后等候太長時間才進行讀板
解決方法:添加終止液后10分鐘內(nèi)進行讀板
?抗體出現(xiàn)非特異性結(jié)合
解決方法:使用合適的封閉緩沖液,比如BSA或5-10%的正常血清。如果使用直接偶聯(lián)的檢測抗體, 則封閉緩沖液種類與一抗相同;如果使用偶聯(lián)二抗,則種類與二抗相同。確保孔已經(jīng)過預(yù)處理以防止非特異性附著。
?高抗體濃度
解決方法:嘗試不同的稀釋度以優(yōu)化結(jié)果
?底物孵育在燈光下進行
解決方法:底物孵育應(yīng)在黑暗中進行或遵循說明書操作
?添加底物后會在孔中形成沉淀
解決方法:增大樣品的稀釋倍數(shù)或降低底物濃度
?酶標板不干凈
解決方法:清洗酶標板底部
4、實驗結(jié)果白板
試驗結(jié)果白板,而且陽性對照孔不顯色,常見原因如下:
?漏加或者誤加試劑
解決方法:檢查試驗記錄和剩余試劑。每次加液前均應(yīng)核對標簽
?試劑過期
解決方法:使用有效期內(nèi)的產(chǎn)品
?洗板液配制中出現(xiàn)問題,如量筒不干凈含HRP酶抑制物(疊氮鈉等)
解決方法:使用干凈的器皿,正確配制試劑
?溫育的時間或溫度不夠
解決方法:校正溫育箱溫度和調(diào)整合適的孵育時間
?標準品失活或者丟失
解決方法:標準品正確保存、溶解和混勻
?抗體失活或者丟失
解決方法:更換抗體或者提高抗體濃度
?酶失活或者丟失
解決方法:把工作濃度的酶再稀釋20-100倍,取5uL加入50ul的顯色底物,終止后顯色是否能達到1.0左右,此為酶的粗略估計。更換酶或者提高酶的濃度
?顯色底物失活
解決辦法:加少量的工作濃度的酶,TMB是否很快顯色檢查,若不顯色,則更換顯色底物
5、標準品/樣本復孔差異大
實驗的標準曲線和測定的重復性差,這是典型的由測定操作引起的問題,常見原因如下:
?加樣本及試劑量不準;孔間不一致
解決方法:
①校正移液器,槍尖要配套,確保移液準確。
②重復某一樣品時,加樣時間盡可能與第一次接近;
③重復測定標本,操作條件、人員等應(yīng)盡可能與上次保持一致,以排除這些因素造成的不一致的可能性;
④樣品稀釋前應(yīng)充分混勻;
⑤樣本應(yīng)保持新鮮無異常。
?加樣過快,孔間發(fā)生污染
解決方法:重復測定標本,操作條件、人員等應(yīng)盡可能與上次保持一致,以排除這些因素造成的不一致的可能性;加樣不要過快
?加錯樣本
解決方法:檢查記錄和試劑,是否加錯樣本
?加樣本及試劑時,加在孔壁上部非包被區(qū)
解決方法:加樣槍頭不要貼壁
?不同批號試劑盒中組分混用
解決方法:不同批號試劑盒中組分不可混用
?溫育時間、洗板、顯色時間不一致
解決方法:檢查時間是否一致
?孔內(nèi)污染雜物
解決方法:離心樣品,排除雜物
?試劑/樣品沒有混勻
解決方法:充分混勻樣品和試劑
?洗滌不符合要求,低于3次或者洗板不徹底
解決方法:嚴格按照說明書規(guī)定進行洗板操作
?血清標本未完全凝固即加入,反應(yīng)孔內(nèi)出現(xiàn)纖維蛋白凝固或殘留血細胞,易出現(xiàn)假陽性反應(yīng)等
解決方法:待血清標本完全凝固后分離樣本做試驗
?孔中有氣泡
解決方法:確保讀取酶標板前不存在氣泡
?邊緣效應(yīng)
解決方法:確保酶標板和所有試劑都處于室溫
6、標準曲線梯度差
?標準溶液配制不當
解決方法: 確認是否正確進行稀釋
?標準品復融不當
解決方法:打開前,短暫離心標準品;檢查復融后是否有未溶解物質(zhì)
?標準品已降解
解決方法:按說明書推薦方式處理并保存標準品
?曲線與標度不合適
解決方法:嘗試使用不同標度繪制曲線,例如對數(shù)-對數(shù)、5-參數(shù)邏輯曲線擬合。
-線性圖:一個坐標軸表示抗原的濃度,另一個表示讀數(shù)。R2值在此通常用于確定擬合,數(shù)值大于0.99表示擬合非常好。然而,線性圖往往會壓縮曲線下端上的數(shù)據(jù)點,導致計算結(jié)果不準。
-半對數(shù)圖:幫助抵消線性圖引起的下端壓縮。半對數(shù)圖使用濃度的對數(shù)與讀數(shù)的關(guān)系。這種方法通常會得到數(shù)據(jù)點分布更均勻的S形曲線。
-對數(shù)/對數(shù)圖:為低到中濃度范圍提供良好的線性。但范圍的高點則容易失去線性。
-4或5參數(shù)邏輯(4PL或5PL)曲線:方法更復雜,考慮了其他參數(shù)比如說高值和低值,因此需要更為復雜的計算。4PL假設(shè)拐點周圍對稱,而5PL考慮了不對此的情況,通常更適合免疫分析。
如果您的軟件允許,則4PL和5PL將適用于大部分ELISA校正標準曲線。如果您的軟件不允許,則可選擇是試用半對數(shù)或?qū)?shù)/對數(shù)圖。
?移液出錯
解決方法:使用校準好的移液器和正確的移液方法。
?標準品溶解方式不正確
解決方法:嚴格按照標簽上說明的方法進行溶解,有些用試劑盒中buffer進行溶解,有些用蒸餾水或者去離子進行溶解等,以說明書為準
?稀釋方式不正確
解決方法:推薦在PP材質(zhì)的EP管中用Dilution buffer稀釋后加樣
?標準品被污染
解決方法:標準品溶解后不宜放置時間過長,在標準品稀釋過程中請勿共用槍頭,標識要清晰
?出現(xiàn)特異孔
解決方法:剔除特異孔后進行標準曲線擬合
?孵育時未加蓋導致溶液揮發(fā)污染
解決方法:加封口膜或者加蓋進行孵育

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